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敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅱ(AP)

Enhanced Sensitive ISH Detection kitⅡ(AP)

MK1032

980元/Kit  

ISH

原位杂交检测试剂盒

现货

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Product Brief

  • 产品概况

    产品货号MK1032
    产品名称敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅱ(AP)
    价格规格¥980/100T/盒
    特异性地高辛标记的寡核苷酸探针
    内容1.胃蛋白酶(×10;Pepsin):2ml;
    2.预杂交液:2ml;
    3.寡核苷酸探针杂交稀释液:2ml;
    4.封闭液:5ml;
    5.生物素化鼠抗地高辛:5ml;
    6.SABC-AP:5ml;
    7.BCIP/NBT:0.5ml;
    8.核固红:6ml;
    9.水溶性封片剂:6ml。


Instructions

描述

所谓原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法,在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生,发展和调控等根本性问题的有力工具,其作用是免疫组化所无法代替的。 博士德专门设计了敏感性加强型原位杂交检测试剂盒。具有敏感性特高,操作简便和结果准确的优点。该试剂盒分为两种,一种为过氧化物酶检测,一种为碱性磷酸酶检测系统。 用于mRNA的杂交。MK1030和MK1032仅适于地高辛高效标记的寡核苷酸探针,不推荐使用每个探针分子仅标记一个地高辛的寡核苷酸探针。
如果使用cDNA探针,应在杂交之前变性探针。

用户自备试剂

原位杂交专用盖玻片;POLY-L-LYSINE;DEPC;20%甘油缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC,0.5×SSC,0.2×SSC, 0.5M TBS )

操作程序

一. 细胞和冰冻切片
准备工作:缓冲液的配备
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g,柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O,分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
0.5 M TBS——1000ml蒸馏水加氯化钠30g,TRIS 1.2g 纯乙酸0.4-0.5ml,PH7.2-7.6。
0.01 M TBS(PH9.0-9.5)配法:1000ml蒸溜水中加NaCl 9g, Tris 1.2g
操作程序:
注意:最重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.4),含有1/1000 DEPC。室温固定 20–30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。0.5M TBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
5.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。 按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱37—40℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
6.杂交——用杂交稀释液 稀释地高辛标记的寡核苷酸探针,浓度一般0.5-2μg/ml。按每张切片加20μι杂交液。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭掉后,盖在切片上。恒温箱37—40℃杂交过夜。
7.杂交后洗涤:去掉盖玻片,30—37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;0.5×SSC洗涤15分钟×1次;0.2×SSC洗涤15分钟×1次。必要时可重复0.2×SSC洗涤1次。
8.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗。
9.滴加生物素化鼠抗地高辛: 37℃60分钟或室温120分钟。0.5M TBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
10.滴加SABC—AP:37℃30分钟。0.5M TBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
11.BCIP/NBT显色:BCIP/NBT (×20)按1:20的比例用0.01M TBS(PH9.5)稀释,混匀。显色液加至标本上。一般30—37℃显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。充分水洗。
12.必要时核固红复染5-15分钟,水洗。
13.水溶性封片剂封片。二.石蜡切片
如果有条件的话,应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后,及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.4),含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块,固定1小时即可,较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感,如动物大脑,固定时间一定不要超过1小时。
1.常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。
3.石蜡切片经常规脱蜡至水。
4.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化3–30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间,例如10分钟,20分钟,30分钟,以找到最佳的消化时间。0.5M TBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
其余步骤和冰冻切片6-13步相同。
结果观察:阳性细胞胞浆着色呈紫蓝色。
注意事项:如果有少量的细胞核着色属于正常情况;如果出现大量的细胞核着色,往往和标本固定时间过长有关,应重新处理标本。有其它明显的非特异性染色现象时,可以用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释,一般稀释2—5倍。

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